① 產生目標序列與選 Cas9
序列長度（bp）300
GC 比例50%
PAM 尋找條件
SpCas9：NGG；SaCas9：NNGRRT
點擊序列中高亮的 PAM，即自動選擇前方 20nt 作為 gRNA。
目前選擇尚未選擇 PAM
DNA 序列（可左右捲動）
② 選擇編輯模式
NHEJ 活性70%
估計：NHEJ 比例越高，小插缺（indel）造成「破框」的機率越高 → 容易達到基因敲除。
預估破框機率：～66%
③ 步驟說明（通用繁中；括號附英）
- NHEJ 敲除（non-homologous end joining, NHEJ）：剪開→細胞自行黏回，常出現小插缺（insertion/deletion, indel），容易讓基因失效。
- HDR 敲入（homology-directed repair, HDR）：同時給「修補模板」（donor DNA / repair template），讓細胞按模板插入/替換（knock-in / replacement）。
- Base Editing（base editing）：不做雙股斷裂（double-strand break, DSB），只改單一鹼基（如 A→G：ABE；C→T：CBE）。
- Prime Editing（prime editing）：不需雙股斷裂，使用含反轉錄模板（reverse transcriptase template）的 pegRNA 在目標位點進行小幅改寫（插入/刪除/替換少數鹼基）。
可將上列內容複製到教材或講義。
④ 離靶（Off‑target）概念示意
背景基因組大小（示意，nt）5000
允許錯配
估計離靶位點數—
此估算僅為教學用，實務需全基因組搜尋與實驗驗證（如 GUIDE‑seq、DISCOVER‑seq、CIRCLE‑seq）。
原理速記：
- 靠近 PAM 的「種子區」越吻合，切割機率越高。
- PAM 條件越寬鬆，可用位點越多，離靶風險可能上升。
- 設計時會用特異性分數與濕實驗來驗證。